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国共合作期间，虽然共产党员在国民党中央占有相当的比例（如中央执委会9名常务委员中有3人，中央党部一处八部21个主要职位中有17人），并帮助创办了黄埔军校，担任了国民革命军各军中的许多高级职位，但就总体而言，这都是在共产国际和陈独秀领导的中共中央只做政治工作、不掌军队实权的指导思想下进行的。孙中山逝世后，掌握了军权的蒋介石等，便逐步背离孙中山的革命政策，开始篡夺国民党的领导权，进行反共活动。1926年3月，蒋介石制造中山舰事件，5月又提出《整理党务决议案》，强迫周恩来等共产党员退出黄埔军校和第一军。中山舰事件又称三二事件。1926年3月18日，海军局代理局长、共产党员李之龙，奉蒋介石的命令派宝璧舰和中山舰，由广州至黄埔。因苏俄代表团要参观中山舰，李之龙向蒋请示可否调中山舰回广州。经蒋同意后，于下午返回广州。蒋介石不承认自己下令调中山舰至黄埔，说是“无故移动”的“不法行动”，并散布谣言，说中山舰要炮轰黄埔军校，共产党要赶走他。以此为借口，蒋介石于3月20日凌晨逮捕了李之龙，同时派出大批军警扣留了中山舰及其他海军舰只，扣留了黄埔军校及第一军第二师共产党员40余人，并将驻防潮汕的第一军中共产党员全部逮捕。周恩来前去质问，亦被软禁一天。最后，国民党中央政治委员会下达了撤除第二师各级党代表的决定。共产党被迫撤出第一军的全部共产党员。
《整理党务决议案》于1926年5月在国民党第二届中央执委会第二次会议上通过。它以“改善中国国民党与共产党间的关系”为名，规定共产党员在国民党“高级党部任执行委员时，其数额不得超过该党部执行委员总数的三分之一”，共产党员“不得充任党中央机关之部长”等。面对国民党右派的进攻，陈独秀、张国焘等中共领导人，不接受毛泽东、周恩来、陈延年等的反对意见，一再采取退让态度，以致黄埔军校和第一军中身份暴露的共产党员全部被迫退出国民党。6月，蒋介石被任命为国民革命军总司令。这时，蒋介石虽然已开始了反共的活动，但国共合作的大局尚未破坏。
1926年7月，国民革命军出师北伐，旨在推翻受帝国主义支持的北洋军阀。北伐出师时共有国民革命军八个军的番号，实际兵力约十万人。早在誓师之前，由共产党建立并直接掌握的叶挺独立团，便已受命为北伐先遣部队，攻入湖南。在渌田、尤家湾首战中，击败吴佩孚军四个团，成为北伐的开路先锋。至1927年4月初，北伐军已消灭了湖南、湖北及江西吴佩孚、孙传芳军的主力，收回了汉口、九江的英租界，在福建、浙江、江苏战场上也取得胜利，并在上海工人第三次武装起义中，夺取了上海。长江以南地区，全部为北伐军占领。冯玉祥部的国民军，也已在共产党的帮助下于绥远五原誓师，挥军南下，控制了陕西、甘肃等省。
正当北伐战争取得伟大胜利、大革命形势蓬勃发展之际，1927年4月12日，蒋介石集团发动了早有预谋的四一二反革命政变。他们首先在上海屠杀工人纠察队和革命群众。工人被杀者300多人，被捕者500多人，而不明不白的失踪者达5000多人。18日，蒋介石在南京另组国民政府，宣布从广州迁至武汉的国民政府及国民党中央的一切决议为非法，陈独秀、谭平山、毛泽东等共产党员和国民党左派等193人的名字被列在第一号通缉令上。紧接着，江苏、浙江、安徽、福建、广东、广西、四川、山西各地国民党，以“清党”为名，大规模屠杀共产党人和革命人民。仅广州被捕杀的共产党员，就有包括原黄埔军校的熊雄、萧楚女等在内的2100余人。与此同时，北方的奉系军阀张作霖也开始捕杀共产党员和革命群众。4月28日，中国共产党的创始人之一李大钊在北京就义。控制武汉国民党的汪精卫，在郑州会议上与冯玉祥会谈后，于7月15日正式作出了“分共”的决定，步蒋介石的后尘，对共产党员和革命人民实行大屠杀。至此，国共合作关系彻底破裂，轰轰烈烈的大革命（第一次国内革命）失败了。北伐的宗旨是反封建军阀、反帝国主义。四一二政变后，蒋介石及其集团转变为依赖帝国主义的新军阀。此后北伐战争虽然最后打败了北洋军阀，表面上统一了中国，但并未改变中国半封建半殖民地的性质，所以说大革命失败了。
血的教训，终于使共产党人真正认识到掌握军队的极端重要性。中共中央指出，当前“最重要的任务之一”，就是“创造新的革命军队，不要有雇佣性质，而要开始于志愿兵的征调，渐进于义务的征兵制，建立工农的革命军”中央档案馆编：《中共中央文件选集》第3册，第340页，中共中央党校出版社1989年版。
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